Реакции осаждения
Белки в растворе и соответственно в организме сохраняются в нативном (природном) состоянии за счет факторов устойчивости, к которым относятся заряд белковой молекулы и гидратная (водная) оболочка вокруг нее. Удаление этих факторов приводит к склеиванию молекул и выпадению их в осадок. Осаждение белков может быть обратимым и необратимым в зависимости от состава реактивов и условий реакций. В клинической лабораторной практике реакции осаждения используют для выделения альбуминовой и глобулиновой фракций (групп) белков плазмы крови, количественной характеристики их устойчивости в плазме, обнаружения белков в биологических жидкостях и освобождения от них с целью получения безбелкового раствора.
Обратимое осаждение
Под действием факторов осаждения белки выпадают в осадок, но после прекращения действия (удаления) этих факторов белки вновь переходят в растворимое состояние и приобретают свои нативные свойства. Одним из видов обратимого осаждения белков является высаливание.
Реакция №1 «Высаливание»
Принцип: насыщенным раствором сульфата аммония осаждается альбуминовая фракция белков, полунасыщенным раствором сульфата аммония – глобулиновая фракция.
Сущность реакции заключается в дегидратации (обезвоживании) молекул белка.
Реактивы: 1) неразбавленный яичный белок; 2) насыщенный раствор сульфата аммония; 3) гидроокись натрия, 10% раствор; 4) сульфат меди, 1% раствор; 5) сульфат аммония в порошке; 6) дистиллированная вода.
Ход определения: в пробирку наливают 30 капель неразведенного яичного белка и добавляют равное количество насыщенного раствора сульфата аммония. Содержимое пробирки перемешивают. Получают полунасыщенный раствор сульфата аммония, при этом глобулиновая фракция белка осаждается, а альбуминовая остается в растворе. Через 5 минут осадок отфильтровывают, на фильтре остается глобулиновая фракция, а в фильтрате – альбуминовая. Осадок с фильтрата снимают стеклянной палочкой и переносят в пробирку, куда добавляют несколько капель воды, пока не растворится осадок. Наличие в растворе белка можно доказать с помощью биуретовой реакции, которая будет положительной.
В пробирку с фильтратом добавляют порошок сульфата аммония до полного насыщения раствора, т.е. до тех пор, пока не прекратится растворение соли. При этом выпадает осадок – альбумины. Его отфильтровывают, осадок с фильтра снимают стеклянной палочкой, растворяют водой и проводят биуретовую реакцию.
Необратимое осаждение
Необратимое осаждение белков связано с глубокими нарушениями структуры белков (вторичной и третичной) и потерей ими своих нативных свойств, т.е. денатурацией. Такие изменения белков можно вызывать кипячением, действием концентрированных растворов минеральных и органических кислот, солями тяжелых металлов и т.д.
Реакция №2 «Осаждение при кипячении»
Принцип: белки являются термолабильными соединениями и при нагревании свыше 50-600С денатурируются. Сущность тепловой денатурации заключается в разрушении гидратной оболочки, разрыве стабилизирующих белковую молекулу связей и развертывании белковой молекулы. Наиболее полное и быстрое осаждение происходит в изоэлектрической точке (когда заряд молекулы равен нулю), поскольку при этом частицы белка наименее устойчивы. Белки, обладающие кислыми свойствами, осаждаются в слабокислой среде, а белки с основными свойствами – в слабощелочной. В сильнокислых или сильнощелочных растворах денатурированный при нагревании белок в осадок не выпадает, т.к. его частицы перезаряжаются и несут в первом случае положительный, а во втором – отрицательный заряд, что повышает их устойчивость в растворе.
Реактивы: 1) яичный белок, 1% раствор; 2) уксусная кислота, 1% и 10% растворы; 3) гидроокись натрия, 10% раствор.
Ход определения: в 4 пронумерованные пробирки приливают по 10 капель раствора яичного белка. Затем 1-ю пробирку нагревают до кипения, при этом раствор белка мутнеет, но так как частицы денатурированного белка несут заряд, они в осадок не выпадают. Это связано с тем, что яичный белок имеет кислые свойства (изоэлектрическая точка его рН 4,8) и в нейтральной среде заряжен отрицательно. Во 2-ю пробирку добавляют 1 каплю 1% раствора уксусной кислоты и нагревают до кипения. Белок выпадает в осадок, так как его раствор приближается к изоэлектрической точке и белок теряет заряд (один из факторов устойчивости белка в растворе). В 3-ю пробирку добавляют 1 каплю 10% уксусной кислоты и нагревают до кипения. Осадка не образуется, так как в сильнокислой среде частицы белка приобретают положительный заряд (сохраняется один из факторов устойчивости белка в растворе). В 4-ю пробирку добавляют 1 каплю раствора гидроокиси натрия и нагревают до кипения. Осадок не образуется, поскольку в щелочной среде отрицательный заряд частиц белка увеличивается.
Реакция №3 «Осаждение солями тяжелых металлов»
Принцип: белки при взаимодействии с солями свинца, меди, ртути, серебра и других тяжелых металлов денатурируются и выпадают в осадок. Однако при избытке некоторых солей наблюдается растворение первоначально образовавшегося осадка. Это связано с накоплением ионов металла на поверхности денатурированного белка и появлением положительного заряда на белковой молекуле.
Реактивы: 1) яичный белок, 1% раствор; 2) сульфат меди, 10% раствор; 3) ацетат свинца, 5% раствор, 4) нитрат серебра, 5% раствор.
Ход определения: в 3 пронумерованные пробирки вносят по 5 капель раствора яичного белка. В 1-ю пробирку добавляют 1 каплю сульфата меди. Во 2-ю пробирку добавляют 1 каплю ацетата свинца. В 3-ю пробирку добавляют 1 каплю нитрата серебра. Во всех пробирках выпадает осадок. Затем в первую пробирку добавляют 10 капель сульфата меди и во вторую пробирку добавляют 10 капель ацетата свинца и наблюдают растворение осадка. В третью пробирку вносят 10 капель нитрата серебра – растворение осадка нет.
Реакция №4 «Осаждение концентрированными минеральными кислотами»
Принцип: концентрированные кислоты (серная, хлористоводородная, азотная и др.) вызывают денатурацию белка за счет удаления факторов устойчивости белка в растворе (заряда и гидратной оболочки). Однако при избытке хлористоводородной и серной кислот выпавший осадок денатурированного белка вновь растворяется. По-видимому, это происходит в результате перезарядки молекул белка и частичного гидролиза. При добавлении избытка азотной кислоты растворение осадка не происходит (точный механизм этого явления не установлен). Вот почему для определения малых количеств белка в моче в клинических лабораториях пользуются азотной кислотой.
Реактивы: 1) яичный белок, 1% раствор; 2) концентрированная серная кислота; 3) концентрированная хлористоводородная кислота; 4) концентрированная азотная кислота.
Ход определения: в 3 пронумерованные пробирки наливают по 10 капель концентрированных кислот: в 1-ю пробирку серную кислоту, во 2-ю пробирку хлористоводородную, в 3-ю пробирку азотную. Затем, наклонив пробирку под углом 450С, осторожно по стенке пробирки (так, чтобы жидкости не смешивались) наслаивают 1 каплю раствора яичного белка. На границе двух слоев появляется осадок белка в виде белого кольца. Осторожно встряхивают пробирки, и добавляют избыток кислот, после чего наблюдают растворение белка в пробирках с серной и хлористоводородной кислотами, а в пробирке с азотной кислотой растворения белка не происходит.
Реакция №5 «Осаждение органическими кислотами»
Принцип: трихлоруксусная кислота осаждает только белки, а сульфосалициловая осаждает не только белки, но и высокомолекулярные полипептиды. Сульфосалициловой кислотой (как самой чувствительной) широко пользуются для обнаружения белка в моче.
Реактивы: 1) яичный белок, 1% раствор; 2) трихлоруксусная кислота, 10% раствор; 3) сульфосалициловая кислота, 20% раствор.
Ход определения: в 2 пронумерованные пробирки приливают по 5 капель раствора яичного белка. Затем в 1-ю пробирку добавляют 2 капли сульфосалициловой кислоты, а во 2-ю пробирку добавляют 2 капли трихлоруксусной кислоты. В пробирках выпадает осадок белка.
