Метод распределительной хроматографии на бумаге

Метод распределительной хроматографии на бумаге является точным и доступным методом для разделения смеси аминокислот. При этом методе в качестве адсорбента используют специальную фильтровальную бумагу. Хроматографию проводят в закрытой камере, чтобы избежать испарения растворителя.

Разделение смеси аминокислот методом распределительной хроматографии на бумаге используют для определения аминокислотного состава белка, для качественного и количественного определения аминокислот в биологических жидкостях и тканях. Этот метод позволяет выделить отдельные вещества из небольшого количества сложной смеси.

Радиальная хроматография является одной из разновидностей метода распределительной хроматографии.

Принцип метода. Отдельные аминокислоты обладают различной растворимостью в двух частично смешивающихся жидкостях, одной из которых является вода, другой – водонасыщенный органический растворитель, например изопропанол (фенол, бутанол и др.) Из двух частично смешивающихся жидкостей один растворитель должен быть полярным (неподвижная фаза), а другой неполярным – подвижная фаза. Более гидрофобная аминокислота или другое вещество, лучше растворяющееся в неполярном растворителе, движется с большей скоростью от линии старта, чем гидрофильная аминокислота. В результате этого смесь аминокислот по окончании хроматогрфического разделения оказывается на разном расстоянии от линии старта.

Радиальную хроматографию проводят на бумаге в чашке Петри. Растворитель перемещается от центра к периферии и захватывает аминокислоты, которые распределяются концентрическими кругами и обнаруживаются после высушивания бумаги и проведения нингидриновой реакции.

Реактивы, оборудование, исследуемый материал

1. Изопропиловый спирт, насыщенный водой (смешать изопропанол с дистиллированной водой в соотношении 7:3)
2. Нингидрин, 0,2% раствор в ацетоне или в этиловом спирте 96%.
3. Чашка Петри (две половинки одного диаметра 11см)
4. Хроматографическая бумага (диск диаметром 12 см. или квадрат со стороной 12 см.)
5. Ножницы
6. Сушильный шкаф
7. Пинцет.
8. Линейка.
9. Карандаш простой.
10. Капельная пипетка или пульверизатор
11. Автоматический дозатор с объёмом на 5 мкл. или капилляр.
12. Пипетка одноразовая
13. Растворы аминокислот

Ход работы:

1. Вырежьте бумажный квадрат со стороной 12 см. или диск диаметром 12 см. Это есть заготовка для хроматограммы (стороны бумажной заготовки должны на 1см быть больше диаметра чашки Петри)
2. Проведите в заготовке диагонали простым карандашом. Заготовку надо держать за края, чтобы избежать появления отпечатков пальцев на хроматограмме!
3. В точке пересечения диагоналей сделайте отверстие (≈ 0,5 см.).
4. Из хроматографической бумаги вырежьте прямоугольник размером 2х3 см., сверните его в трубочку по длине прямоугольника – это ножка для заготовки.
5. Оденьте ножку в отверстие заготовки.
6. Отступив от центра на 1 см, в каждом секторе заготовки обводите простым карандашом кружки диаметром ≈ 0,5 см. и обозначьте их цифрами 1,2,3,4.
7. В кружки 1,2,3 нанесите соответствующие аминокислоты аланин (1), глутаминовая (2), лейцин (3), а в кружок 4 нанесите смесь этих аминокислот. Для каждой аминокислоты надо брать чистый наконечник! Размер пятна наносимой аминокислоты не должен выходить за края кружка.
8. После нанесения аминокислот заготовку необходимо просушить 10 минут на воздухе, чтобы не было влажного пятна.
9. На дно чашки Петри налейте 10 – 12 мл водонасыщенного раствора изопропилового спирта. Заготовку положите на чашку Петри так, чтобы ножка заготовки была погружена в раствор, а сама бумажная заготовка лежала на краях нижней половинке чашки. Чашку Петри накройте крышкой (если ножка высока, то подрежьте её ножницами до нужной высоты) и проведите хроматографическое разделение в течение часа при комнатной температуре. По ножке растворитель поднимается вверх и распределяется по окружности бумаги, увлекая за собой нанесённые аминокислоты. При этом происходит разделение исследуемой смеси на отдельные аминокислоты, движущиеся с разной скоростью, соответственно коэффициентам их распределения меду водой и изопропанолом.
10. Когда фронт растворителя дойдёт почти до края заготовки, крышку чашки Петри снимите, на неё положите сверху заготовку, удерживая пинцетом её края, обведите простым карандашом фронт растворителя.
11. Поместите хроматограмму в термостат при температуре 90 – 100^оС на 10 минут с целью устранения растворителя и фиксации аминокислот.
12. Остатки растворителя пипеткой слейте обратно в ёмкость.
13. Для выявления пятен аминокислот хроматограмму опрысните 0,2% раствором нингидрина из пульверизатора ( или залейте из пипетки) и вновь высушите в сушильном шкафу при температуре 90 – 100^оС 5 минут. При этом проявляются аминокислоты в виде отдельных полос, окрашенных в розово-фиолетовый цвет, где каждое пятно соответствует определённой аминокислоте.
14. Сравнивая расположение пятен в исследуемой смеси в секторе 4 (опыт) с положением пятен отдельных аминокислот в секторах 1,2,3 (контролях), установите присутствие в смеси определённых аминокислот. Для чего рассчитайте для каждой аминокислоты коэффициент распределения – Rf или скорость перемещения по формуле: Rf = a/b, где a – расстояние в миллиметрах, пройденное аминокислотой от места нанесения аминокислоты до середины её пятна; b – расстояние в миллиметрах от места нанесения аминокислоты до фронта растворителя. Чем меньше растворимость аминокислоты в воде и чем больше её растворимость в органическом растворителе, тем быстрее она движется вслед за фронтом растворителя, тем больше величина Rf, и, наоборот, чем больше её растворимость в воде и меньше в органическом растворителе, тем медленнее аминокислота будет передвигаться и тем меньше величина Rf. Коэффициент распределения Rf – величина постоянная для каждой аминокислоты при постоянных условиях опыта (температура, сорт бумаги, растворитель).
15. Сравните коэффициенты распределения известных стандартных аминокислот (в контрольных секторах 1,2.3) с коэффициентом распределения аминокислот, выделенных из исследуемой смеси ( в опытном секторе 4) и сделайте вывод о наличие отдельных аминокислот в исследуемом материале.
16. Запишите вывод, хроматограмму приклейте или прикрепите степлером в тетрадь.