Методы разделения белков и аминокислот

Хроматографический метод определения аминокислот

ХРОМАТОГРАФИЯ - метод разделения, анализа и физико-химического исследования веществ. Хроматография обычно основана на распределении исследуемого вещества между двумя фазами - неподвижной и подвижной (элюент).

Неподвижная (стационарная) фаза – представляет собой сорбент с развитой поверхностью, а подвижная (мобильная) фаза - поток газа (пара, флюида - вещество в сверхкритичном состоянии) или жидкости. Поток подвижной фазы фильтруется через слой сорбента или перемещается вдоль слоя сорбента.

Хроматография - процесс разделения веществ, находящихся в смеси или растворе, на составляющие компоненты в системе двух фаз, одна из которых неподвижна, а другая перемещается относительно первой. Перемещение способствует миграции веществ, при этом неподвижная фаза не изменяется, а каждый компонент движется независимо от других с собственной скоростью.

Хроматографические методы применяют для сорбционно-динамического разделения смеси аминокислот, белков, углеводов, липидов и их метаболитов.

В зависимости от природы адсорбента и механизма разделения веществ хроматографию подразделяют на несколько видов:

1. Адсорбционная – основана на различной способности отдельных компонентов смеси (в силу их различной полярности) адсорбироваться на поверхности твёрдой фазы сорбента. Этот метод предложен М. С. Цветом в 1903 году. В качестве сорбентов используются активированный древесный уголь, окись алюминия или кремния.

2. Распределительная – основана на различной растворимости разделяемых веществ в двух малосмешивающихся жидкостях; в отличие от адсорбционной, твердая фаза служит опорой (основой) для стационарной (неподвижной) фазы. Разновидностью распределительной хроматографии является хроматография на бумаге, широко используемая в биохимических и клинических лабораториях для разделения белков, пептидов, аминокислот и других веществ.

3. Ионообменная – основана на различной способности разделяемых веществ к обмену их ионов на ионы неподвижной фазы сорбента. В качестве неподвижной фазы сорбента применяются ионообменные смолы – полимерные органические соединения, содержащие функциональные группы, способные вовлекаться в ионный обмен. Различают анионообменники, представленные органическими основаниями и аминами, и катионообменники, содержащие фенольные, сульфо- или карбоксильные группы. В зависимости от заряда разделяемых белков используют подходящую ионообменную смолу, с функциональными группами которой обменивается часть белков и задерживается на колонке, в то время как другие белки беспрепятственно выносятся из колонки. «Осажденные» на колонке белки снимают с колонки применением более концентрированных солевых растворов или изменением рН элюента.

4. Осадочная – основана на образовании труднорастворимых осадков в определённой последовательности.

5. Диффузионная – основана на разделении веществ по скорости диффузии внутрь сорбента в зависимости от размера молекул. К данному типу относится гель-фильтрация - разделение веществ, основанное на механическом явлении молекулярных сит (просеивания). Этот метод широко используется при очистке белков от примесей и для фракционирования белков плазмы.

6. Аффинная (хроматография сродства) – основана на принципе избирательного взаимодействия белков (или других макромолекул) со специфическими веществами – лигандами, закрепленными на носителе. Благодаря высокой специфичности сродства белков к определенному лиганду, связанному с носителем (которым заполняют хроматографическую колонку) присоединяется только один какой-нибудь белок из смеси. Затем этот белок снимают с колонки элюированием буферными смесями с измененным рН или иной ионной силой, а также введением в состав элюента детергентов, ослабляющих связи между белками и лигандами. Достоинством этого метода является то, что с его помощью удается выделить одноэтапно заданный белок или другой биополимер высокой степени чистоты. При помощи аффинной хроматографии, например, определяют гликозилированный гемоглобин, являющийся наиболее достоверным показателем гликемии.

По технике выполнения хроматографические методы исследования подразделяют на колоночную и плоскостную (на бумаге или в тонком слое).

В зависимости от агрегатного состояния фаз хроматографию подразделяют на газовую, жидкостную, газожидкостную.

По направлению движения растворителя (подвижной фазы) хроматографию подразделяют на восходящую, нисходящую, одномерную, двухмерную и радиальную.