Построение калибровочного графика.
Для построения калибровочного графика из основного стандартного раствора белка готовят 3 серии рабочих стандартных растворов (т.е. для каждой концентрации делают не менее 2 – 3 определений), как указано в табл. 1 (0,1 мл основного стандартного раствора содержит 0,01 г белка). Из каждого разведения берут по 0,1 мл рабочего раствора и вносят в пробирки, содержащие 5,0 мл рабочего биуретового реактива. Через 30-60 мин замеряют оптическую плотность стандартных и опытных проб против биуретового реактива.
Измерения абсорбции начинают производить с раствора меньшей концентрации.
Таблица 1
Построение калибровочного графика для определения
общего белка сыворотки крови
| №/№ пробирок | Стандартный раствор белка, мл | Физиологический раствор NaCl, мл | Концентрация белка, г/л |
| 1 2 3 4 5 6 7 | 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 | 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 - | 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0 |
По полученным данным строят калибровочный график на миллиметровой бумаге. На оси абсцисс (горизонтальной) обозначают значения концентраций, на оси ординат (вертикальной) – средние значения экстинкций, соответствующие взятым концентрациям белка. Через полученные точки (а при необходимости – между ними) проводят прямую линию. Масштаб выбирают так, чтобы линия располагалась под углом, близким к 450 (рис. 1).
Иногда характер графика для большинства концентраций белка несколько отклоняется от прямой линии, однако если результаты стабильно повторяются, такой график вполне пригоден для работы.
Калибровочную кривую нужно время от времени проверять. При этом достаточно проверить 2 – 3 точки. Если они укладываются на прежнем графике, то он не переделывается. Для облегчения подсчетов составляют таблицу или вычисляют фактор пересчета F делением концентрации белка на абсорбцию F = Сcm/Ecm.
Фактор пересчета F используют для расчета концентрации белка в исследуемой пробе. Для этого экстинкцию (абсорбцию) пробы Еоп умножают на фактор пересчета F:
концентрация белка (г/л) = Eоп●F.
